Der Xiphoidkern des Mittellinien-Thalamus kontrolliert die Kälte

Natur (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur ist für endotherme Tiere kalorienintensiv1. Säugetiere fressen in der Kälte mehr, um den Energieverbrauch auszugleichen2, der neuronale Mechanismus, der dieser Kopplung zugrunde liegt, ist jedoch nicht vollständig verstanden. Durch Verhaltens- und Stoffwechselanalysen haben wir herausgefunden, dass Mäuse in der Kälte dynamisch zwischen Energieeinsparungs- und Nahrungssuchzuständen wechseln, wobei letztere in erster Linie durch den Energieverbrauch und nicht durch das Kälteempfinden gesteuert werden. Um die neuronalen Mechanismen zu identifizieren, die der kälteinduzierten Nahrungssuche zugrunde liegen, verwendeten wir eine c-Fos-Kartierung des gesamten Gehirns und stellten fest, dass das Xiphoid (Xi), ein kleiner Kern im Mittellinien-Thalamus, durch längere Kälte, die mit einem erhöhten Energieverbrauch einhergeht, selektiv aktiviert wurde nicht bei akuter Kälteeinwirkung. In-vivo-Kalzium-Bildgebung zeigte, dass die Xi-Aktivität mit Episoden der Nahrungssuche unter kalten Bedingungen korreliert. Unter Verwendung aktivitätsabhängiger viraler Strategien fanden wir heraus, dass die optogenetische und chemogenetische Stimulation kälteaktivierter Xi-Neuronen die Nahrungssuche unter kalten Bedingungen selektiv rekapitulierte, während ihre Hemmung sie unterdrückte. Mechanistisch gesehen kodiert Xi einen kontextabhängigen Valenzwechsel, der das Nahrungssuchverhalten unter kalten, aber nicht unter warmen Bedingungen fördert. Darüber hinaus werden diese Verhaltensweisen durch eine Xi-zu-Nucleus-acumbens-Projektion vermittelt. Unsere Ergebnisse belegen, dass Xi eine Schlüsselregion bei der Kontrolle der kälteinduzierten Fütterung ist, einem wichtigen Mechanismus für die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase bei endothermen Tieren.

Das Aufkommen der Endothermie brachte im Laufe der Evolution zahlreiche adaptive Vorteile mit sich; Allerdings ging damit auch ein deutlicher Anstieg des Energieaufwands einher. Um diesen erhöhten Energiebedarf zu decken, passen Säugetiere ihr Futtersuchverhalten als Reaktion auf Temperaturänderungen dramatisch an und es besteht ein enger, untrennbarer Zusammenhang zwischen Umgebungstemperatur und Nahrungsaufnahme: Je kälter die Umgebung, desto mehr Nahrung wird benötigt, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten1,2 ,3. Es ist bekannt, dass Säugetiere, darunter auch Menschen, in der Kälte mehr fressen. Verschiedene Feste in verschiedenen Kulturen mit üppigen Festen im Winter sind ein Zeugnis unserer endothermen evolutionären Vergangenheit4,5,6. Allerdings bleiben die neuronalen Grundlagen, die den Energiebedarf aufgrund der Kälte und die Zunahme der Nahrungsaufnahme verknüpfen, in unserem Verständnis der Säugetierbiologie unbeantwortet.

Nagetiere sind ein hervorragendes Modell, um diesen Zusammenhang zwischen Temperatur und Energieverbrauch zu untersuchen7. Beispielsweise können Labormäuse (Mus musculus) ihre tägliche Nahrungsaufnahme verdoppeln, wenn sie bei 4 °C leben, wobei die Thermogenese unter diesen Bedingungen etwa 60 % des gesamten Energieverbrauchs des Körpers ausmacht8. Obwohl gezeigt wurde, dass das Kälteempfinden die Nahrungsaufnahme über konservierte somatosensorische und Nahrungszentren im Gehirn sowohl bei Ektothermen als auch bei Endothermen9,10,11,12,13 stark beeinflusst, bleibt unklar, ob – und wie – der durch Kälte verursachte Energieaufwand durch Nahrung kompensiert wird Aufnahme. Hier haben wir hochauflösende Stoffwechsel- und Verhaltensanalysen kombiniert, um zu zeigen, dass eine erhöhte Nahrungsaufnahme bei Kälte eine Folge des Energieverbrauchs ist; Darüber hinaus identifizierten wir den Mittellinien-Thalamus-Xiphoid-Kern (Xi) als einen wichtigen Knotenpunkt, der die kompensatorische Zunahme des Nahrungssuchverhaltens vermittelt.

Es wurde berichtet, dass die Unterbringung von Mäusen bei 4 °C zu einer erhöhten Thermogenese, einem erhöhten Energieverbrauch und einer erhöhten Nahrungsaufnahme führt8,14. Um einen detaillierteren Überblick über den Energieverbrauch zu erhalten, verwendeten wir indirekte Kalorimetrie, um den Energieverbrauch einer einzelnen Maus in Echtzeit durch Messung des Sauerstoff- und Kohlendioxidaustauschs zu bestimmen15. Zeitlich aufgelöste indirekte Kalorimetrie zeigte, dass eine Umstellung der Umgebungstemperatur von 23 auf 4 °C den Energieaufwand sofort erhöhte (Abb. 1a, b und erweiterte Daten Abb. 1a–f). Es gab jedoch einen anfänglichen Rückgang und eine erhebliche Verzögerung zwischen dem Temperaturabfall und der erhöhten Nahrungsaufnahme (Abb. 1b), was darauf hindeutet, dass ein schnelles Kältegefühl möglicherweise nicht die direkte Ursache für die durch Kälte verursachte Nahrungsaufnahme ist. Nach der Quantifizierung des zeitlichen Zusammenhangs zwischen Energieverbrauch und Nahrungsaufnahme stellten wir fest, dass mit fortschreitender Kälteexposition die Nahrungsaufnahme stärker mit dem Energieverbrauch korrelierte (beginnend 5–6 Stunden nach der Kälteexposition und danach erhöht; Abb. 1c). Auf der Grundlage dieser fortschreitenden Korrelation definierten wir diesen Zeitraum von 5 bis 6 Stunden nach der Kälteexposition als Beginn der kälteinduzierten Energiekompensation (CIEC) und konzentrierten uns für den Rest der Studie, einschließlich der Videoaufzeichnung, auf dieses Zeitfenster von Mäusen in diesem Zeitraum, um diese Verhaltensweisen besser zu verstehen.

a, Neunzigstündiger Verlauf des Energieverbrauchs (EE) und der Nahrungsaufnahme (n = 24 Mäuse). Der Energieverbrauch wird in Grün und die Nahrungsaufnahme in Schwarz dargestellt; Linien und Schattierungen bezeichnen Mittelwert bzw. Halbwert jeder Gruppe. b, Vergrößerte Ansicht von a während des Wechsels von 23 auf 4 °C. c, Streudiagramm, das die Beziehung zwischen Energieverbrauch und Fütterung über einen Zeitraum von 11 Stunden nach dem Temperaturwechsel darstellt (während des Lichtzyklus, n = 24 Mäuse). Jeder Punkt stellt den durchschnittlichen Energieverbrauch und die Nahrungsaufnahme aller Mäuse zu jeder Stunde dar. Die Pfeilspitzen zeigen die entscheidende Übergangsperiode (5–6 Stunden) nach Beginn der Kälte an. d–f, Verhaltensanalyse von Tieren, die sich einer CIEC mit einem HMM unterziehen. Wir haben ein HMM mit drei Zuständen definiert: (1) Energieeinsparung; (2) Erkundung mit Fütterung; und (3) Erkundung ohne Fütterung. Wir haben die anfängliche geschätzte Übergangsmatrix erstellt, indem wir für alle Übergänge gleiche Wahrscheinlichkeiten angenommen haben, da wir keine A-priori-Informationen hatten. d, Repräsentative Verhaltensereignisse, die für eine männliche C57BL/6J-Maus bewertet wurden, nachdem sie 5 Stunden lang kalten Bedingungen ausgesetzt war. e, Darstellung des HMM der CIEC-assoziierten Fütterung (n = 3 Mäuse). f, Prozentsatz der in jedem HMM-Zustand verbrachten Zeit. g, Vergrößerte Ansicht einer 10-minütigen Sitzung von e, die die HMM-Zustandszuweisung zeigt. h, Schematische Darstellung des Clearings des gesamten Gehirns und der volumetrischen dreidimensionalen Bildgebung zur Identifizierung von Gehirnregionen, die während der CIEC aktiviert werden. i, c-Fos-Kartierungsergebnisse für den Thalamus. Jeder Punkt stellt die c-Fos+-Zellzahl in jeder einzelnen Region basierend auf der Allen Brain Atlas-Registrierung dar; Die Punktgröße stellt den Unterschied in der Signaldichte zwischen den beiden Bedingungen dar. Bei thermoneutraler Temperatur aktivierte Strukturen sind orange schattiert, bei kalten Bedingungen aktivierte Strukturen blau.

Interessanterweise blieben die Mäuse trotz der insgesamt erhöhten Nahrungsaufnahme bei Kälte meist unbeweglich, anstatt sich aktiv auf Nahrungssuche zu begeben (Abb. 1d). Diese Beobachtung deutete darauf hin, dass die Mäuse statt einer einseitigen Steigerung des Appetits mit konkurrierenden Prioritäten zwischen der Energieeinsparung für die Thermogenese (durch Unbeweglichkeit) und der Wiederauffüllung der Energieversorgung (durch Nahrungssuche) konfrontiert waren. Allerdings zeigten Mäuse unter kalten Bedingungen auch verschiedene nicht fressende, thermoregulierende Verhaltensweisen, wie z. B. das Herausholen und Ordnen der Einstreu (Abb. 1d). Um die Beziehungen zwischen diesen Verhaltensweisen besser zu verstehen, haben wir sie zunächst in 15 spezifische Aktionen eingeteilt und mithilfe eines unbeaufsichtigten Hidden-Markov-Modells (HMM) drei unterschiedliche Zustände identifiziert, die die Mäuse zeigten: Zustand 1, einen Energieerhaltungszustand, in dem sie sich größtenteils befanden unbeweglich; Zustand 2, ein Erkundungszustand mit Nahrungssuche und der höchsten Wahrscheinlichkeit zu essen; und Zustand 3, ein Erkundungszustand ohne Nahrungssuche, in dem Mäuse andere Aktionen ohne Nahrungsaufnahme ausführten (Abb. 1d – g und erweiterte Daten Abb. 2a – c). Diese Analyse ermöglichte es uns, anstelle der 15 spezifischen Aktionen nur drei HMM-Zustände zu verwenden, um den CIEC-induzierten Fütterungszustand (Zustand 2) selektiv zu untersuchen. Da Zustand 1 der vorherrschende Zustand ist (Abb. 1f), haben wir uns bei allen nachfolgenden Analysen auf die Charakterisierung ausgehender Zustandsübergänge von Zustand 1 konzentriert.

Um die Schaltkreismechanismen zu identifizieren, die der CIEC-induzierten Fütterung zugrunde liegen, führten wir zunächst ein gehirnweites c-Fos-Screening16,17 an Mäusen durch, die entweder bei 4 oder 30 °C gehalten wurden (Mäuse-Thermoneutralität, zur Maximierung gehirnweiter Aktivitätsunterschiede). für 6 Stunden unter Verwendung von Ganzhirn-SHIELD (Stabilisierung unter rauen Bedingungen über intramolekulare Epoxidbindungen zur Verhinderung von Abbau), Immunfluoreszenzmarkierung, Lichtblattbildgebung und automatisierter Analyse (Abb. 1h und Ergänzungstabelle 1)18,19,20. Kältebedingungen führten zu einem breiten Rückgang des c-Fos-Signals im Kortex, was wahrscheinlich auf die allgemeine Abnahme der körperlichen Aktivität dieser Tiere zurückzuführen ist (Extended Data Abb. 3a – c). Der Hypothalamus, in dem die Thermoregulation im Mittelpunkt steht21, zeigte erwartungsgemäß eine robuste c-Fos-Aktivierung (Extended Data Abb. 3a,d). Während der größte Teil des Thalamus unter kalten Bedingungen unterdrückt wurde, zeigten überraschenderweise mehrere ventrale Mittellinien-Thalamusregionen (vMT) eine höhere Aktivierung (Abb. 1i). Wir haben uns aus zwei Gründen entschieden, dieses Gebiet weiter zu erkunden. Erstens wurde beim Sibirischen Hamster (einem Modell für Kälteanpassungen) berichtet, dass Läsionen am vMT die Kälteanpassung im Winter beeinträchtigen22. Zweitens wurde kürzlich bei Mäusen gezeigt, dass das vMT ein entscheidender Knotenpunkt ist, um zu steuern, wie interne Zustände in gegensätzliche Verhaltensreaktionen (z. B. Einfrieren versus Kämpfen) auf wahrgenommene Bedrohungen übersetzt werden21, ein Szenario, das den konkurrierenden Prioritäten zwischen Energieeinsparung und Energieeinsparung ähnelt Verhaltensweisen bei der Nahrungssuche, die wir im CIEC beobachtet haben.

Um anschließend zu unterscheiden, ob die vMT-Aktivierung aufgrund eines Kälteempfindens erfolgte oder mit CIEC zusammenhängt, untersuchten wir die c-Fos-Expression nach entweder 5 Stunden (zur Modellierung von CIEC) oder 15 Minuten (zur Modellierung von akutem Gefühl) der Kälteexposition (Abb. 2a). . Beide Bedingungen induzierten c-Fos im mittleren präoptischen Kern, einer Schlüsselregion für die Thermoregulation (Extended Data Abb. 4b). Allerdings führten bereits 5 Stunden Kälteexposition zu einer c-Fos-Aktivierung im Xi, verglichen mit 15 Minuten Kälteexposition oder Unterbringung bei 30 °C; Diese Aktivierung wurde im benachbarten Nucleus Reuniens nicht beobachtet (Abb. 2b, c und Extended Data Abb. 4a). Nachdem wir den Zeitraum von 5 bis 6 Stunden nach der Kälteexposition als Beginn von CIEC bezeichnet haben (Abb. 1c), definieren wir diese c-Fos + Xi-Neuronen als die XiCIEC-Population, deren Aktivierung wahrscheinlich eher auf CIEC als auf akute Ereignisse zurückzuführen ist Kältegefühl. Diese selektive Xi-Aktivierung wurde auch nach einer längeren Kälteperiode (7 Tage) beobachtet (Extended Data Abb. 4c). Darüber hinaus zeigten sowohl männliche als auch weibliche Mäuse während der CIEC eine Aktivierung des Xi (Extended Data Abb. 4d).

a, Schematische Darstellung verschiedener Kälteexpositionsparadigmen zur Kennzeichnung der c-Fos-Expression. b, c-Fos+-Neuronen (grün) im vMT für jede in a gezeigte Bedingung. Gelb umrandete Kästchen zeigen vergrößerte Bilder der Xi-Region. Maßstabsbalken, 200 μm. CM, zentraler medialer Kern; IAM, intratereomedialer Kern; Re, Kernreuniens. c, Quantifizierung von c-Fos+-Zellen unter jeder Bedingung (n = 14 Abschnitte von vier Mäusen für jede Bedingung). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ****P < 0,0001; NS, nicht signifikant unter Verwendung der gewöhnlichen einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. d, Schematische Darstellung des Faserphotometrie-Aufbaus für die Aufnahme vom Xi. e, Repräsentatives Bild von GCaMP6m-markierten Xi-Neuronen. Maßstabsbalken, 500 μm. f,g, Faserphotometriesignal von AAV-GCaMP6m-exprimierenden vMT/Xi-Neuronen unter kalten (f) und thermoneutralen (g) Bedingungen, dargestellt als Durchschnitt von 18 Ereignissen von vier verschiedenen Mäusen. Die durchgezogene Linie stellt den Durchschnitt dar, die schattierte Fläche den Halbwert; Die rote gestrichelte Linie stellt den Beginn der Fütterung dar. Einfügungen zeigen ein Beispiel einer einzelnen Spur. h,i, Balkendiagramme der Fläche unter der Kurve (AUC) dF/F (−20 bis 10 s) (h) und der maximale dF/F-Prozentsatz (i) für Faserphotometriedaten in f bzw. g. j, Faserphotometriesignal, ausgerichtet auf den Zustandsübergang 1–2 (rote gestrichelte Linie), basierend auf HMM, gemittelt aus 11 Ereignissen von drei verschiedenen Mäusen; Die durchgezogene Linie stellt den Durchschnitt dar und der schattierte Bereich ist Sem. Der Einschub zeigt ein Beispiel einer einzelnen Kurve. k,l, Balkendiagramme von AUC (−10 bis 10 s) (k) und Peak dF/F (l), quantifiziert aus j und erweiterten Daten Abb. 4. Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ***P = 0,004 für AUC ( h), ****P < 0,0001 für Spitzen-dF/F (i), **P = 0,0017 für AUC (k) und **P = 0,0024 für Spitzen-dF/F (l) unter Verwendung zweiseitiger ungepaarter Daten T-Test. au, beliebige Einheiten.

Um in Echtzeit zu bestimmen, wie die Xi-Aktivität verschiedene Verhaltenskomponenten darstellt, die durch kalte Bedingungen hervorgerufen werden, haben wir die Kalziumdynamik des Xi in vivo mithilfe der Faserphotometrie aufgezeichnet (Abb. 2d, e). In Übereinstimmung mit den c-Fos-Ergebnissen (Abb. 2b, c) stellten wir fest, dass ein akuter Temperaturabfall (23 auf 4 ° C) nicht zur Aktivierung des Xi führte (Extended Data Abb. 4e). Als nächstes analysierten wir die Xi-Kalziumdynamik während der CIEC-assoziierten Nahrungssuche. Frei bewegliche Mäuse wurden vor der Aufzeichnung der Faserphotometrie 5 Stunden lang kalten Bedingungen mit Futter und Wasser ausgesetzt. Vor jedem Fütterungsereignis unter kalten Bedingungen kam es zu einem deutlichen Anstieg der Xi-Aktivität. Dies wurde jedoch bei Fütterungsperioden bei thermoneutraler Temperatur (nicht CIEC) bei denselben Personen nicht beobachtet (Abb. 2f – i), was darauf hindeutet, dass die Xi-Aktivität selektiv war mit CIEC-induzierter Nahrungsaufnahme verbunden. Um zusätzliche Einblicke in die kälteinduzierte Xi-Aktivität zu gewinnen, haben wir ein Szenario mit einem verschärften kälteinduzierten Energiedefizit (CIEC+) erstellt, indem wir den Nahrungszugang während der ersten drei Stunden der Kälteexposition kurzzeitig eingeschränkt haben. Unter CIEC+-Bedingungen beobachteten wir weitere erhöhte Xi-Kalziumtransienten bei denselben Tieren, was darauf hindeutet, dass die Xi-Aktivität mit CIEC skalierbar war (Extended Data Abb. 4f – h). Darüber hinaus reagierten Xi-Neuronen weder bei Raumtemperatur noch bei 30 °C auf kanonische, durch Fasten induzierte Nahrungsaufnahme (Extended Data Abb. 4j – l), was darauf hindeutet, dass ihre Aktivität spezifisch mit CIEC, aber nicht mit einem damit verbundenen allgemeinen Energiedefizit zusammenhängt Lebensmittelbeschränkung. Die Plasmaspiegel von Glukose und Leptin, die normalerweise beim Fasten sinken, blieben während der CIEC unverändert (Extended Data Abb. 1j und 5a,b), während es erhöhte Spiegel an Lipolyseprodukten gab (Extended Data Abb. 5c–f), was darauf hindeutet, dass nicht- Kanonische Signalwege signalisieren dem Gehirn den CIEC-Zustand, obwohl die genaue molekulare Natur eines solchen Signalwegs noch geklärt werden muss.

Durch die weitere Einbeziehung von HMM-Zuständen in die Analyse der Faserphotometrie entdeckten wir, dass die Xi-Aktivität stark mit dem Übergang zwischen dem energiesparenden Zustand (Zustand 1) und dem Nahrungssuche-Zustand (Zustand 2) verbunden ist, nicht jedoch mit dem Übergang zwischen Zustand 1 und dem Nicht nach Nahrung suchender Erkundungszustand 3 (Abb. 2j – l und erweiterte Daten, Abb. 4i), was darauf hindeutet, dass die Xi-Aktivität nicht mit allgemeinen Erkundungsbewegungen verbunden ist. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Xi-Neuronen während des Übergangs zwischen den Zuständen 1 und 2 spezifisch aktiviert werden, was zu einer kompensatorischen Fütterung in einer Weise führt, die mit zunehmender Amplitude bei höheren CIEC-Werten skaliert.

Der zeitliche Zusammenhang zwischen Xi-Aktivität und CIEC-induzierter Nahrungssuche veranlasste uns zu der Frage, ob Xi-Neuronen dieses Verhalten kausal modulieren könnten. Allerdings handelt es sich beim Xi um einen kleinen, weniger untersuchten Mittellinien-Thalamuskern ohne klar definierte Grenzen oder molekulare Marker23,24. Da CIEC selektiv c-Fos im Xi induzierte, ohne die umliegenden Bereiche zu aktivieren (Abb. 2b), stellten wir die Hypothese auf, dass wir diese XiCIEC-Neuronen aufgrund ihrer einzigartigen Aktivierungsgeschichte während früherer Kälteexpositionen angreifen könnten. Unter Nutzung einer zuvor validierten vCAPTURE-Strategie17,25,26,27,28 basierend auf aktivitätsabhängigem ESARE-ER-Cre-ER29 zielten wir auf kälteaktivierte Xi-Neuronen mit einem hM3Dq (Gq-gekoppelten humanen muskarinischen M3-Designer-Rezeptor, der ausschließlich durch eines davon aktiviert wird). eine Designerdroge (DREADD) oder eine Kontrolle mit rot fluoreszierendem Protein (RFP); Abb. 3a–c). In Übereinstimmung mit der Spezifität und Effizienz früherer CAPTURE- und gezielter Rekombinationsarbeiten in aktiven Populationen25,27,29 stellten wir fest, dass XiCIEC-Neuronen bei 4 °C effizient eingefangen wurden und dass diese Neuronen stark mit kälteinduzierten c-Fos+-Neuronen überlappten (89,9 ±). 6,7 % durch c-Fos/CAPTURE, 52,6 ± 12,4 % durch CAPTURE/c-Fos), wohingegen minimale Neuronen bei 30 °C eingefangen wurden (Abb. 3a, d–f und 2a, b).

a, Schematische Darstellung der Injektionsstelle für AAV-eSARE-ER-Cre-ER und AAV-DIO-hM3Dq oder RFP-Kontrolle im Xi. b, Schematische Darstellung der aktivitätsabhängigen Markierungsstrategie von vCAPTURE, die zur Expression von hM3Dq DREADD in CIEC-aktivierten Xi-Neuronen verwendet wird. c, Schematische Darstellung der Verfahren zur aktivitätsabhängigen Erfassung von CIEC-Neuronen im Vergleich zu Nicht-CIEC-Neuronen im Xi. Für vCAPTURE von XiCIEC-Neuronen wurde Mäusen 5 Stunden nach der Exposition gegenüber kalten Bedingungen (4 °C) Tamoxifen verabreicht. RT, Raumtemperatur. d, Repräsentative Histologie von Nicht-CIEC-Mäusen (30 °C, oben) und CIEC-Mäusen (4 °C, unten), die für die c-Fos-Doppelmarkierung verwendet wurden. Links: vCAPTURE-vermittelte hM3Dq-Markierung in der vMT/Xi-Region; Mitte: CIEC-aktivierte c-Fos-Markierung; rechts: Überlagerung von vCAPTURE und c-Fos-Doppelbeschriftung. Maßstabsbalken, 500 μm e,f, Quantifizierung der c-Fos-Doppelmarkierung mit vCAPTURE-Neuronen im Xi (16 Abschnitte von n = 4 Mäusen). Captured-Gq-Gesamtzahlen (e) und Überlappung mit 4 °C c-Fos (f). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ****P < 0,0001 unter Verwendung des zweiseitigen ungepaarten t-Tests. g, Balkendiagramm, das die Nahrungsaufnahme nach Aktivierung von XiCIEC- im Vergleich zu Xinon-CIEC-Neuronen im Vergleich zu RFP-Kontrollen zeigt (n = 5 Mäuse pro Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung *P = 0,0397 und NS = 0,7374 unter Verwendung einer gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Korrektur für mehrere Vergleiche. h,i, Schematische Darstellung der vCAPTURE-Strategie (h) und -Prozedur (i), die zum Testen des Funktionsverlustexperimentes mit DREADD-Gi(hM4Di) verwendet wird. Beachten Sie, dass den Mäusen in diesem Experiment vor der Injektion von CNO kurzzeitig eine Nahrungsbeschränkung (angezeigt durch graue Balken) auferlegt wurde, um die Grundfütterung zu erhöhen. YFP, gelb fluoreszierendes Protein. j, Balkendiagramm, das die Nahrungsaufnahme nach Hemmung von XiCIEC-Neuronen zeigt (n = 4 Mäuse für RFP und n = 4 für Gi). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ***P = 0,0003 unter Verwendung des zweiseitigen ungepaarten t-Tests. 4-TM, 4-Hydroxytamoxifen.

Nach der Reaktivierung durch Clozapin-N-oxid (CNO) beobachteten wir eine signifikant erhöhte Nahrungsaufnahme bei Mäusen, die mit hM3Dq unter kalten Bedingungen (XiCIEC) behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen, die mit der RFP-Kontrolle oder bei 30 ° C (Xinon-CIEC) behandelt wurden (Abb. 3g). ). Anschließend verwendeten wir dieselbe vCAPTURE-Strategie, um XiCIEC-Neuronen mit einem hemmenden hM4Di-DREADD anzusprechen. Nach CNO-vermittelter Hemmung wurde im Vergleich zur RFP-Kontrolle ein signifikanter Rückgang der CIEC-induzierten Nahrungsaufnahme beobachtet (Abb. 3h – j und Extended Data Abb. 6a). Im Gegensatz dazu wirkte sich weder die chemogenetische Hemmung noch die Aktivierung auf die Nahrungsaufnahme bei Raumtemperatur aus (Extended Data Abb. 6b, c), was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass die Rolle von Xi-Neuronen spezifisch für die durch Kälte verursachte Nahrungsaufnahme ist.

Um zu verstehen, wie XiCIEC-Neuronen die Nahrungsaufnahme bei höherer zeitlicher Auflösung fördern, haben wir uns der Optogenetik zugewandt. Wir injizierten zunächst ChR2-exprimierendes AAV direkt in die vMT-Region und analysierten das Fütterungsverhalten in einem CIEC-Szenario (Extended Data Abb. 7a,b). Die optogenetische Stimulation der vMT-Volumenregion führte zu einer höheren Nahrungsaufnahme, verursachte aber auch einen schnellen Anstieg der Gesamtbewegung, der bei der natürlichen Anpassung an kalte Bedingungen nicht beobachtet wurde (Extended Data Abb. 7c – f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die unspezifische Aktivierung benachbarter Neuronen außerhalb des Xi möglicherweise die Verhaltensausgabe beeinträchtigt hat.

Um die Spezifität zu verbessern, verwendeten wir erneut das aktivitätsabhängige vCAPTURE-System, um ChR2 selektiv in XiCIEC-Neuronen zu exprimieren (Abb. 4a, b). Die Photostimulation von ChR2-exprimierenden XiCIEC-Neuronen führte im Vergleich zu RFP-Kontrollen zu einem starken Anstieg der Nahrungsaufnahme ohne Veränderungen der allgemeinen Bewegung (Abb. 4c – f) oder in einem Freilandtest (Extended Data Abb. 8a – d). Interessanterweise führte die Photostimulation von XiCIEC-Neuronen in Abwesenheit von Kälte (dh bei Nagetier-Thermoneutralität von 30 ° C) nur zu einer geringfügigen, aber nicht signifikanten Änderung der Nahrungsaufnahme (Extended Data Abb. 8e – h), was darauf hinweist dass XiCIEC-Neuronen einen CIEC-Zustand benötigen, um bei Tieren eine echte Fütterung zu induzieren. Darüber hinaus zeigte die Videoanalyse, dass die Photoaktivierung von XiCIEC zu mehr Übergängen vom energiesparenden HMM-Zustand 1 zum nahrungssuchenden Zustand 2 führte, während die Übergänge von Zustand 1–3 nicht verändert wurden (Abb. 4g, h). In ähnlicher Weise erhöhte sich die Gesamtzeit, die im Zustand 2 verbracht wurde, nach der Photostimulation (Abb. 4i und erweiterte Daten Abb. 8i). Diese Ergebnisse weisen in Kombination mit den früheren Daten der Faserphotometrie darauf hin, dass die XiCIEC-Aktivität speziell die CIEC-induzierte Nahrungsaufnahme fördert, ohne andere allgemeine bewegungsbezogene Aktionen zu beeinträchtigen.

a, Schematische Darstellung der Virusinjektion, Faserplatzierung und repräsentative histologische Bilder. Maßstabsbalken, 500 μm. b, Schematische Darstellung der optogenetischen experimentellen Verfahren von vCAPTURE. Stim., Anregung. c,d, Unterschied in der Nahrungsaufnahme unter kalten Bedingungen für ChR2-Mäuse (n = 9 Mäuse, n = 18-mal) (c) und für RFP-Kontrollmäuse (n = 7 Mäuse, n = 13-mal) (d). e,f, Unterschied in der körperlichen Aktivität unter kalten Bedingungen für ChR2-Mäuse (n = 9 Mäuse, n = 18-mal) (e) und für RFP-Kontrollmäuse (n = 7 Mäuse, n = 9-mal) (f). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ****P < 0,0001 (c), NS = 0,6953 (d), NS = 0,6287 (e) und NS = 0,7252 (f) unter Verwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests. g, Gesamtzahl der Übergänge von Zustand 1 (Energiesparzustand) zu Zustand 2 (Erkundung mit Fütterung) bei ChR2-Mäusen (n = 7 Mäuse). h, Zustandsübergang von Zustand 1 zu Zustand 3 (Erkundung ohne Fütterung). i, Gesamtzeit, die in verschiedenen Staaten verbracht wurde (n = 7 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ***P = 0,0005 (g), NS = 0,8779 (h), ***P = 0,0006 (i, links) und **P = 0,0046 (i, rechts) unter Verwendung zweiseitiger Paare T-Test. j–m, RTPP-Test. j,k, Repräsentative Heatmaps einer ChR2-Maus (j) und RFP-Kontrolle (k). l, Quantifizierung des Prozentsatzes der auf der stimulierten Seite verbrachten Zeit. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. ****P < 0,0001 für ChR2-Basislinie gegenüber ChR2 4 °C und ChR2 RT gegenüber ChR2 4 °C; NS = 0,4589 für die ChR2-Basislinie im Vergleich zur ChR2-RT; NS = 0,7083, 0,9985 und 0,9648 für RFP-Basislinie gegenüber RT, 4 °C bzw. RFP RT gegenüber 4 °C unter Verwendung einer gewöhnlichen Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (n = 11 für ChR2 und n = 6 für RFP-Kontrolle). ). m, Prozentuale Änderung der Präferenz zwischen der in der Stimulationskammer verbrachten Zeit, normalisiert auf den Laser-Off-Basalwert (n = 11 für ChR2 und n = 6 für RFP-Kontrolle). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung ****P < 0,0001 für ChR2 RT gegenüber ChR2 4 °C, NS = 0,6887 für RFP RT gegenüber RFP 4 °C unter Verwendung einer gewöhnlichen Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest.

Um zu beschreiben, wie Xi-Neuronen Verhaltensübergänge beeinflussen, verwendeten wir als Nächstes die Echtzeit-Ortspräferenz (RTPP), um die mit der Xi-Aktivierung verbundene Valenz zu bestimmen. XiCIEC ChR2-exprimierende Mäuse wurden zunächst ohne Laserstimulation in eine Zweikammer-Arena gebracht, um die Basalplatzpräferenz zu bestimmen. Während des RTPP wurden XiCIEC-Neuronen stimuliert, als die Mäuse eine Seite der Arena betraten, und dies hörte auf, als sie auf die andere Seite wechselten (Abb. 4j, k). Bei Raumtemperatur änderte die XiCIEC-Aktivierung die Ortspräferenz nicht. Wenn RTPP jedoch unter kalten Bedingungen (4 °C) durchgeführt wurde, wechselten dieselben Tiere ihre Präferenz auf die lichtstimulierte Seite (Abb. 4j – m). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserem zustandsabhängigen Aktivitätsmuster, das in früheren Faserphotometriestudien gefunden wurde (Abb. 2f, g). Darüber hinaus war ein solcher zustandsabhängiger Valenzschalter nur bei ChR2-exprimierenden Mäusen und nicht bei RFP-Kontrollen vorhanden. Die RTPP-Ergebnisse legen nahe, dass der Xi-vermittelte Zustandsübergang bei der Nahrungssuche während der CIEC durch eine positive Valenz vorangetrieben werden könnte.

Schließlich versuchten wir, die Zelltypen und Projektionsziele des Xi zu charakterisieren. Zunächst stellten wir unter Verwendung von vGLUT2-Cre- und vGAT-Cre-Mäusen 30, 31 fest, dass die Xi-regulierte Nahrungssuche hauptsächlich durch glutamaterge Neuronen im Xi und nicht durch GABAerge Zellen vermittelt wurde (Erweiterte Daten Abb. 9a – l). Als nächstes injizierten wir das mCherry-exprimierende Adeno-assoziierte Virus (AAV), um die Projektionsziele von Xi abzubilden. In Übereinstimmung mit früheren Berichten23,24 projizierte Xi auf den Nucleus accumbens (NAc), die basolaterale Amygdala (BLA) und den anterioren cingulären Kortex (ACC) (Abb. 5a, b). Da Xi jedoch eine kleine Region ist und wir derzeit keinen genetischen Marker für CIEC-aktivierte Xi-Neuronen haben, sollten wir hier beachten, dass unsere Tracing-Studien eine Einschränkung hinsichtlich der Ausrichtung auf benachbarte Regionen wie PVH und Re aufweisen. Um weiter zu bestätigen und festzustellen, ob eine oder mehrere dieser Projektionen der XiCIEC-Population entsprachen, haben wir ein Doppelmarkierungsexperiment entworfen, bei dem retrograde CTB-Farbstoffe einzeln in NAc, BLA und ACC injiziert wurden. Wir fanden heraus, dass die höchste Überlappung zwischen kälteaktiviertem c-Fos und CTB in Xi-NAc-projizierenden Neuronen auftrat (Abb. 5d – g), was uns dazu veranlasste, die Rolle der Xi-NAc-Projektion bei der kälteinduzierten Fütterung zu testen. Wir injizierten ChR2-exprimierendes AAV in den Xi und implantierten eine optische Faser entweder über NAc, BLA oder ACC (Abb. 5i, j, oben und erweiterte Daten Abb. 9a). Die Photoaktivierung der Xi-NAc-Projektion, jedoch nicht der Xi-zu-ACC- oder BLA-Projektion, führte zu einem signifikanten Anstieg der Nahrungsaufnahme (Abb. 5i, j und erweiterte Daten Abb. 10a, b). Diese projektionsspezifischen Effekte wurden weiter bestätigt, indem zwei Faserimplantate (NAc und BLA) bei denselben Tieren verwendet wurden, jedoch nacheinander fotostimuliert wurden (Extended Data Abb. 10c – g). Schließlich stellten wir mithilfe von RTPP auch fest, dass die Aktivierung der Xi-zu-NAc-Projektion zu einer kälteabhängigen positiven Valenz führte, während die Aktivierung anderer Projektionen dies nicht bewirkte (Abb. 5k, l). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Xi-zu-NAc-Projektion hauptsächlich kälteinduziertes Verhalten bei der Nahrungssuche vermittelt.

a,b, Schematische Darstellung der anterograden tdTomato-Markierung (a). Mäusen wurde AAV-CaMKIIa-tdTomato an den Xi- und Axonfasern injiziert, die in ACC, BLA und NAc (b) beobachtet wurden (n = 5 Mäuse). c–f, Schema (c) und repräsentative Überlagerungsbilder zwischen retrograden CTB- und c-Fos-Signalen am Xi: ACC-Xi (d), BLA-Xi (e) und Xi-NAc (f). Maßstabsbalken, 200 μm. g, Quantifizierung der CTB/c-Fos-Überlappung. n = 5 für ACC, n = 6 für BLA und n = 4 für NAc. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. ****P < 0,0001 für ACC gegenüber NAc und ***P = 0,0002 für BLA gegenüber NAc unter Verwendung einer gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. H. Schematische Darstellung projektionsspezifischer optogenetischer Experimente. i,j, Quantifizierung der Veränderung der Nahrungsaufnahme und körperlichen Aktivität nach Stimulation der Xi-NAc- (i) und Xi-ACC-Projektion (j) während CIEC (n = 8 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. **P = 0,0052 für Nahrungsaufnahme, NS = 0,9163 für körperliche Aktivität für Xi-NAc (i); NS = 0,8037 für die Nahrungsaufnahme und NS = 0,5893 für körperliche Aktivität für Xi-ACC unter Verwendung eines zweiseitigen gepaarten t-Tests (j). k,l, Projektionsspezifischer RTPP-Test. Die RFP-Kontrolle wurde in den Xi injiziert und am Xi zur Kontrolle aller Projektionen (n = 8 Mäuse) stimuliert. k, Prozentsatz der auf der Laserstimulationsseite verbrachten Zeit. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. ****P < 0,0001 für Xi-NAc RT im Vergleich zu Xi-NAc 4 °C, NS = 0,3027 für Xi-ACC RT im Vergleich zu Xi-ACC 4 °C, NS > 0,99 für RFP RT im Vergleich zu RFP 4 °C (n = 8 Mäuse pro Gruppe). l, Prozentuale Änderung der Präferenz nach der Stimulation, normalisiert auf die Basis-Ortspräferenz für dasselbe Tier. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. ***P = 0,0003 für Xi-NAc RT im Vergleich zu Xi-NAc 4 °C, NS = 0,6413 für Xi-ACC im Vergleich zu Xi-ACC 4 °C und NS > 0,99 für RFP RT im Vergleich zu RFP 4 °C unter Verwendung einer gewöhnlichen Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (n = 8 Mäuse pro Gruppe).

Durch den Einsatz von Ganzhirn-Screening, In-vivo-Kalziumbildgebung sowie chemo- und optogenetischen Manipulationen konnten wir zeigen, dass der Xi-Kern als Schlüsselregion des Gehirns bei der Förderung von kälteinduziertem Nahrungssuchverhalten fungiert. Obwohl über kältebedingte Nahrungsaufnahme bei allen Tierarten, einschließlich Menschen, weithin berichtet wurde, deutete unsere Studie darauf hin, dass eine solche Nahrungsaufnahme weder eine direkte Reaktion auf Kälteempfindungen noch eine einseitige Zunahme des Nahrungssuchverhaltens war, sondern vielmehr ein dynamisches Ergebnis der Übergangsprioritäten zwischen Energieeinsparung und Energienachschub als Reaktion auf eine erhöhte Kalorienschuld bei Kälte.

Obwohl die Xi-Aktivität mit Verhaltensänderungen verbunden war (Abb. 2j), kehrte sie interessanterweise vor Beginn der Fütterung auf den Ausgangswert zurück (Abb. 2f), was darauf hindeutet, dass für die Fütterung keine anhaltende Xi-Aktivität erforderlich ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass vMT/Xi Verhaltensänderungen zwischen Strategien zur Reduzierung und Verbesserung der Ausprägung als Reaktion auf visuelle Bedrohungen bei Mäusen steuert25. In Anlehnung an diese Verschiebung spekulierten wir, dass die endogene Xi-Aktivität Verhaltensübergänge von der Energieeinsparung zu einem auffüllenden (Fütterungs-)Zustand steuern könnte, da die experimentelle Aktivierung von Xi die CIEC-assoziierte Nahrungsaufnahme erhöhte (Abb. 3g und 4c), möglicherweise durch Senkung des erforderlichen Schwellenwerts um die Wahrscheinlichkeit von Zustandsübergängen 1–2 zu erhöhen (Abb. 4g–i). Dieses Gating ist jedoch spezifisch für den kalten Kontext, in dem die Koordinierung von Energieaufwand und -aufnahme überlebenswichtig ist: Es scheint weniger in Hungerbedingungen involviert zu sein, in denen der Drang zur Nahrungsaufnahme eher einseitig ist (Erweiterte Daten, Abb. 4). Diese Spezifität legt nahe, dass zusätzliche CIEC-assoziierte Eingaben wie Metaboliten, Hormone oder interozeptive Signale, die auf eine oder mehrere vorgelagerte Regionen von Xi wirken, für Xi-vermittelte Verhaltens-Gating- und Valenzübergänge erforderlich sind. Weitere Studien sind erforderlich, um die Identität und Mechanismen dieser Eingaben aufzuklären. In Übereinstimmung mit allen verfügbaren Beweisen schlagen wir vor, dass das Xi einen wichtigen Mechanismus für den dynamischen Wechsel gegensätzlicher Überlebensstrategien während spezifischer natürlicher Verhaltensweisen darstellen könnte.

Das Fressverhalten wird sowohl durch homöostatische als auch durch Belohnungskreise streng reguliert32,33,34. Das Xi ist eine weniger erforschte Gehirnregion, die kein direkter Bestandteil des klassischen hypothalamischen oder limbischen Belohnungssystems ist. Es projiziert jedoch auf mehrere bekannte Regionen, die an der Nahrungsregulierung beteiligt sind, einschließlich des präfrontalen Kortex, BLA und NAc21 (Abb. 5a, b). Wir fanden heraus, dass Xi-reguliertes Fütterungs- und Valenzwechselverhalten hauptsächlich durch die Xi-NAc-Projektion vermittelt wurde. Als limbisches Belohnungszentrum ist bekannt, dass das NAc motivierende und sensorische Signale integriert, um die motorische Leistung35,36 zu steuern und die Nahrungsaufnahme zu regulieren37,38. Auf der Grundlage unserer Ergebnisse schlagen wir vor, dass NAc ein wichtiges nachgelagertes Ziel von Xi bei der Motivation von Tieren ist, Verhaltenszustände zu ändern, die durch den internen Stoffwechselzustand vorgegeben werden. Es muss jedoch noch ermittelt werden, wie die Xi-Aktivität mit anderen Aspekten des kanonischen Ernährungsrahmens interagiert oder integriert wird und insbesondere, welche Identität ihre Eingangssignale haben.

Obwohl die Nahrungsaufnahme zu den am ausführlichsten untersuchten Verhaltensweisen von Nagetieren gehört, wurde sie vor allem im Zusammenhang mit Nahrungsrestriktionen (z. B. Fasten über Nacht) bei der Entstehung einer negativen Energiebilanz modelliert. Kälteinduziertes Füttern bietet ein neues Paradigma zur Untersuchung des Appetits, der durch den Energieverbrauch gesteuert wird. Obwohl sowohl Nahrungseinschränkung als auch Energieverbrauch insgesamt zu einer negativen Energiebilanz führen, kann sich die Physiologie des Organismus deutlich unterscheiden – zum Beispiel ist Fasten mit einem niedrigeren Blutzucker-, Leptin- und Insulinspiegel sowie einer unterdrückten Thermogenese und Grundstoffwechselrate verbunden, wohingegen Kälteadaption damit einhergeht hohe Glukoseverwertung, erhöhte Thermogenese und höhere Stoffwechselraten. Kälteinduzierte Energiekompensation und damit verbundene neuronale Substrate (wie das Xi und viele andere, die auf dem Gesamthirnbildschirm angezeigt werden) könnten einen Einstiegspunkt zum Verständnis des naturalistischen Energiedefizits bieten, das durch andere Zustände mit hohem EE-Gehalt wie Bewegung und Stillzeit verursacht wird wird nicht nur für das Verständnis der grundlegenden Säugetierbiologie wichtig sein, sondern auch für Fettleibigkeit und Gewichtsmanagement.

Tierversuche wurden entweder am Scripps Research Institute, La Jolla oder am Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Die Experimente wurden entweder vom Institutional Animal Care and Use Committee des Scripps Research Institute oder des Beth Israel Deaconess Medical Center genehmigt. Die Experimente wurden an Mäusen im Alter von 2–6 Monaten durchgeführt. Wildtyp-C57BL/J6-Mäusen wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen Viren injiziert und man ließ sie sich mindestens eine Woche lang erholen, bevor Experimente oder eine experimentelle Gewöhnung durchgeführt wurden. Die Gruppengröße wurde nicht auf der Grundlage des statistischen Potenzgesetzes, sondern auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Studien festgelegt. Die Tiere wurden vor der Virusinjektion zufällig verschiedenen Versuchsgruppen zugeordnet. Für die Histologie und c-Fos-Markierung wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Männliche Mäuse wurden für freilaufende Verhaltensstudien verwendet.

AAV8-hSyn-DIO-Gq–mCherry (Addgen, Nr. 44361-AAV8), AAV8-hSyn-DIO-Gi–mCherry (Addgen, Nr. 44362-AAV8), AAV8-hSyn-mCherry (Addgen, Nr. 114472- AAV8) und AAV9-Syn-GCaMP6m-WPRE-SV40 (Addgene, Nr. 100841-AAV9) wurden von Addgene erhalten.

AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST wurde von UNC erhalten und AAV8-Ef1a-DIO hChR2(H134R)-p2AScarlett und AAV8-CaMKIIa-hChR2-p2A-oScarlet wurden von Stanford erhalten. Der c-Fos-Antikörper wurde im Handel erworben (Cell Signaling, Nr. 2250), ebenso wie CNO (Hallo, Nr. HB1807).

Mäuse wurden in einer Induktionskammer mit 3,0 % Isofluran anästhesiert und nach 5 Minuten wurden die Köpfe der Tiere mithilfe von Ohrbügeln an einem stereotaktischen Gerät (Kopf) befestigt. Mäuse wurden während der Operation auf einem warmen Heizkissen unter 0,8–1,2 % Isofluran gehalten (die Körpertemperatur wurde bei 36 °C gehalten). Die Köpfe wurden rasiert, um Haare zu entfernen, und mit einer Skalpellklinge wurde ein Schnitt in der Mittellinie gemacht, um den Schädel freizulegen. Der Kopf wurde mithilfe eines Bregma- und Lambda-Systems auf dem stereotaktischen Kopfstand ausbalanciert. Mit Zahnbohrern wurden oberhalb der Injektionsstelle kleine Kraniotomien durchgeführt. Das Virus wurde mit einem Nanoject II-Injektor (Drummond), der an eine 10-μl-Hamilton-Spritze angeschlossen war, mit 75 nl min-1 infundiert. Die Nadel wurde vor dem Herausziehen 10 Minuten lang an der Injektionsstelle belassen. Den Mäusen wurde erlaubt, sich 1–2 Wochen lang zu erholen, bevor Experimente oder eine experimentelle Gewöhnung durchgeführt wurden.

Zur chemogenetischen Stimulation wurde ein Cocktail aus 125–150 nl AAV8-hSyn-DIO-Gq–mCherry oder AAV8-hSyn-mCherry und AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST in die vMT/Xi-Region (Bregma, −1,0 mm; Mittellinie 0 mm; Rückenfläche −4,4 mm). Die Endkonzentration an ESARE-Viren im Cocktail betrug 7 × 1012 genomische Kopien ml–1. Zwei Wochen nach der Operation wurden die Mäuse an die Injektion von Tamoxifan gewöhnt (vCAPTURE-Markierung von XiCIEC-assoziierten Neuronen).

Für optogenetische Experimente mit nicht-selektiver Aktivierung der gesamten vMT/Xi-Region (Bregma, –1,0 mm; Mittellinie, 0 mm; Rückenfläche, –4,4 mm) wurden 150 nl AAV8-CaMKIIa-hChR2-p2A-oScarlet (5 × 1012 genomische Kopien ml–1) wurden in die vMT/Xi-Region injiziert. Nach dem Entfernen der Nadel wurde eine optische Faserkanüle (200 μm Durchmesser, 0,22 Numerische Apertur (NA), RWD Life Science) am vMT/XI 100–200 μm dorsal der Injektionsstelle implantiert (Bregma, –1,0 mm; Mittellinie). , 0 mm; Rückenfläche, –4,2 bis –4,3 mm). Die optische Kanüle wurde mit Zahnzement am Schädel befestigt. Für die aktivitätsabhängige optogenetische Markierungskohorte wurden 200 nl eines Cocktails aus AAV8-Ef1a-DIO hChR2(H134R)-p2AScarlett + AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST (7 × 1.012 genomische Kopien ml–1) injiziert in der vMT/Xi-Region.

Für Faserphotometrie-Experimente wurden 150–180 nl des AAV9-Syn-GCaMP6m-WPRE-SV40-Virus (7 × 1012 genomische Kopien ml–1) mittels stereotaktischer Chirurgie in die vMT/Xi-Region (Bregma, –1,0 mm; Mittellinie, 0 mm; dorsale Oberfläche, –4,4 mm) und eine optische Faserkanüle (400 μm Durchmesser, 0,5 NA, RWD Life Science) wurde implantiert (Bregma, –0,9 mm; Mittellinie, 0 mm; dorsale Oberfläche, –4,2 mm). Sowohl für die Optogenetik als auch für die Faserphotometrie wurde nur eine Einfaser-Optikkanüle implantiert, da es sich bei Xi um eine Mittellinienstruktur handelt.

Für die Kälteexposition wurde ein temperaturgesteuerter Nagetier-Inkubator (Nr. RIS28SSD, Powers Scientific) verwendet, der auf 4 °C gehalten wurde. Für Thermoneutralitätsbedingungen wurde ein temperierter Warmraum mit einer Temperatur von 30 °C verwendet. Bei allen Temperaturexpositionsexperimenten wurden alle Mäuse einzeln mit einer kleinen Menge Einstreumaterial gehalten, um sicherzustellen, dass jedes Individuum der gleichen Temperaturexposition ausgesetzt war. Zur Kälteexposition wurden die Tiere direkt in den 4 °C warmen Inkubator in einem Käfig ohne Deckel überführt, um den Temperaturausgleich zu erleichtern. Mäuse hatten während der meisten Kälte- und Wärmeexpositionsexperimente freien Zugang zu Futter und Wasser, mit Ausnahme der CIEC+-Bedingung und während inhibitorischer chemogenetischer Experimente, bei denen die Nahrungsaufnahme für verschiedene Zeiträume eingeschränkt wurde, wie in den einzelnen Abbildungen angegeben.

Für das nicht-selektive Optogenetik-Experiment durften sich die Mäuse 7 Tage nach der optogenetischen Implantation erholen, für die vCAPTURE-Mäusekohorte 14 Tage nach der Tamoxifen-Injektion. Optogenetische Mäuse wurden trainiert und an Pellets (20 mg Pellets, Nr. F0071, Bioserv) zusammen mit dem Pellet-Ausgabesystem FED2 (Ref. 39) in ihrem Heimkäfig für 5 Tage gewöhnt, bevor ihnen für 4 Tage freier Zugang zu Futterpellets gewährt wurde Tage, um die Entwicklung eines hedonischen Werts für Futterpellets zu vermeiden. Vor dem ersten Experiment wurden die Mäuse 5 Tage lang mit Futterpellets und FED2 weiter an die Verhaltenskammern gewöhnt. Alle Nahrungsaufnahmeexperimente wurden zwischen 08:00 und 15:00 Uhr durchgeführt, um den Einfluss des natürlichen zirkadianen Zyklus auf das Fressverhalten zu vermeiden.

Für optogenetische Experimente wurden Versuchsmäuse über eine optische Faser (200 μm Durchmesser, 0,22 NA, RWD Life Science) an einen Blaulichtlaser (473 nm) angeschlossen. Das Licht wurde 10 Minuten lang in 10-ms-Impulsen bei 20 Hz, 3 s an/2 s aus, abgegeben. Die Lichtleistung an der Faserspitze betrug 10 mW. Für chemogenetische Experimente wurde ein normales Futterpellet zur Messung der Nahrungsaufnahme nach Gewicht verwendet, um den Durchsatz zu erhöhen. Die CNO-Stammlösung wurde frisch durch Auflösen in DMSO hergestellt und dann in Kochsalzlösung verdünnt; Mäusen wurden 3 mg kg–1 CNO zur Aktivierung der Gq-Kohorte und 5 mg kg–1 für die inhibitorische Gi-Kohorte injiziert. Kontrollmäusen wurde die gleiche Menge CNO verabreicht wie der Versuchsgruppe.

Stoffwechselkäfigdaten wurden für 24 einzeln gehaltene Mäuse aufgezeichnet, die in einem indirekten Promethion-Kalorimeter (Sable Systems) mit einem temperaturgeregelten Schrank (Pol-Eko) untergebracht und mit Ad-libitum-Nahrung (Labdiet 5008, 3,56 kcal g–1) und gereinigtem Wasser versorgt wurden durch Umkehrosmose. Die Mäuse wurden bei einer Umgebungstemperatur von 23 ± 0,2 °C unter 12/12-stündigen Licht-/Dunkel-Photoperioden (06:00–18:00 Uhr) gehalten. Temperaturübergänge von 23 auf 4 °C wurden über einen Zeitraum von 3 Stunden ab 06:00 Uhr durchgeführt. Die Daten wurden mit Macro Interpreter, Makro 13 (Sable Systems) vor der Analyse in CalR v.1.3 (Ref. 40) exportiert. Die Energieaufwandsraten wurden mithilfe der Weir-Gleichung41 berechnet. Es wurden zwei Datensätze analysiert. Datensatz 1: 24 Mäuse wurden 2,5 Tage (62 Stunden) bei 23 °C gehalten. Die Umgebungstemperatur wurde weitere 9 Stunden lang auf 4 °C gehalten, bevor sie 16 Stunden lang wieder auf 23 °C zurückkehrte. Datensatz 2: 11 Mäuse wurden 5 Tage (115 h) bei 23 °C gehalten, gefolgt von weiteren 5 Tagen (118 h) bei 4 °C (Extended Data Abb. 1c – e).

Um CIEC-assoziierte Neuronen in der vMT/XI-Region mit aktivierendem Gq-DREADD zu markieren, erhielten Mäuse eine stereotaktische Injektion eines Viruscocktails mit ESARE-ER-Cre-ER + DIO-Gq und wurden 2–3 Tage lang jeden Tag an das Setup gewöhnt h für 1 Woche. ESARE-ER-Cre-ER/Gq-Mäuse wurden zufällig in XiCIEC- und Xinon-CIEC-Gruppen eingeteilt. Am Tag der Markierung wurde die XiCIEC-Mäusegruppe 6 Stunden lang mit Ad-libitum-Nahrung und Wasser in kalte Bedingungen gebracht. Den Mäusen wurden 6 Stunden nach der Kältebehandlung 20 mg kg–1 4-TM (Sigma, Nr. H6278) durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Wenn diese Mäuse CIEC betreten, induzieren die vMT/Xi-Neuronen, die während CIEC aktiv sind, FOS und CreERT2. Nach der 4-TM-Injektion rekombiniert CreERT2 selektiv das AAV8-hSyn-DIO-Gq–mCherry-kodierende Cre-abhängige Gq-DREADD in der Zelle, die FOS exprimierte. Diese Rekombination führt zu einer dauerhaften Expression von Gq-DREADD in diesen Zellen, die dann zu einem späteren Zeitpunkt durch Verabreichung des DREADD-Agonisten CNO selektiv aktiviert werden kann. Nach den 4-TM-Injektionen wurden diese Mäuse weitere 2 Stunden unter kalten Bedingungen gehalten, bevor sie in ihren Heimkäfig zurückgebracht und bei 23 °C gehalten wurden. Als Kontrolle erstellten wir eine weitere Kohorte von Mäusen, die eine stereotaktische Injektion des gleichen Viruscocktails wie XiCIEC erhielten und nach demselben Protokoll gewöhnt wurden, mit der Ausnahme, dass sie am Tag der Markierung eine 4-TM-Injektion von 20 mg kg–1 erhielten nachdem es 6 Stunden lang bei 30 °C gehalten wurde, anstatt es unter kalten Bedingungen aufzubewahren. Die c-Fos-Daten in Abb. 1 zeigen, dass im Vergleich zum Szenario unter kalten Bedingungen nur sehr wenige Zellen in der vMT/Xi-Region aktiv waren, während Mäuse 6 Stunden lang unter thermoneutralen Bedingungen waren. Wir nennen diese Kohorte von Mäusen Xinon-CIEC. Beide Mäusegruppen wurden zur gleichen Tageszeit injiziert, um eine mit dem zirkadianen Rhythmus verbundene Markierungsvariabilität zu vermeiden. Ein ähnliches Protokoll wurde für die optogenetischen Mäuse befolgt, die eine stereotaktische Injektion eines Viruscocktails aus AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST und AAV8-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-p2AScarlett erhielten.

Mäuse wurden vor der transkardialen Perfusion mit eiskaltem PBS mit Isofluran anästhesiert, gefolgt von kalter 4 %iger Paraformaldehyd (PFA). Die Gehirne wurden entnommen und über Nacht mit 4 % PFA bei 4 °C nachfixiert. Am folgenden Tag wurden fixierte Gehirne in 3% Agarose getaucht und zum Einbetten 2 Stunden lang unter kalten Bedingungen aufbewahrt. Gehirne wurden auf einem Vibratom (Leica VT1000S) in koronale Schnitte von 80 μm geschnitten und als zwei gleiche Sätze in einer mit PBS gefüllten Platte mit sechs Vertiefungen gesammelt. Zur Permeabilisierung der immunhistochemischen Färbung wurden Gehirnschnitte mit einem Blockierungspuffer, der PBS, 0,3 % TritonX-100 (PBST) und 5 % Eselserum enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Permeabilisierung wurden die Gehirnschnitte 16 Stunden lang bei 4 °C in einem Blockierungspuffer mit primären Antikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Hirnschnitte dreimal jeweils 20 Minuten lang mit PBST gewaschen, um ungebundene Primärantikörper abzuwaschen, und dann 1 Stunde lang mit sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur, verdünnt in Blockierungspuffer, inkubiert. Abschließend wurden die Hirnschnitte erneut dreimal für jeweils 20 Minuten mit PBST gewaschen, um ungebundene Sekundärantikörper abzuwaschen, bevor sie auf Super-Frost-Plus-Glasobjektträgern (VWR) montiert wurden. Gehirnschnitte wurden mit einem konfokalen Olympus FV3000-Mikroskop mit 10-fachem Objektiv, 0,6 numerischer Apertur und Wasserimmersion (XLUMPlanFI, Olympus) abgebildet. Jeder Gehirnschnitt wurde mit einem Z-Stapel von 10 μm abgebildet. Die c-Fos-Quantifizierung wurde für eine einzelne Ebene (Zahlen mm–2) durchgeführt. Für die Quantifizierung mit c-Fos vCAPTURE mit doppelter Markierung wurden die Zellen in einem interessierenden Bereich gezählt, der manuell anhand anatomischer Orientierungspunkte definiert wurde. Für die Histologie verwendete Antikörper sind: c-Fos-Antikörper (Cell Signaling, Nr. 2250, verdünnt 1:400), Anti-Kaninchen-488 (Jackson Immuno Research, Nr. 711-546-152, verdünnt 1:400).

Wildtyp-C57BL/J6-Mäuse wurden vor dem eigentlichen Experiment fünf Tage lang an den Verhaltensaufbau gewöhnt. Am Tag des Experiments wurden einzeln gehaltene Mäuse vor der Perfusion 6 Stunden lang entweder unter kalten (4 °C) oder thermoneutralen (30 °C) Bedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Gehirne wurden geerntet und über Nacht in 4 % PFA fixiert. Die Gesamthirnreinigung, Bildgebung und automatisierte Analyse wurden von LifeCanvas Technologies im Rahmen eines Vertragsdienstes durchgeführt. Kurz gesagt, fixierte ganze Gehirne wurden mit SHIELD (Stabilisierung unter rauen Bedingungen über intramolekulare Epoxidbindungen zur Verhinderung von Abbau) hergestellt, um die Proteinantigenität zu bewahren, bevor sie mithilfe von SmartBatch+ aktiv gereinigt und mit einem c-Fos-Antikörper immunmarkiert wurden. Markierte Gehirne wurden von EasyIndex indexiert und mittels volumetrischer Lichtblattmikroskopie (SmartSPIM) abgebildet, gefolgt von Bildnachbearbeitung, Zellquantifizierung, Atlasregistrierung und regionalen Grafiken. Die durchschnittliche Anzahl von c-Fos+-Zellen in jeder Region wurde basierend auf ABA-Anmerkungen zur Datenvisualisierung in sieben „Buckets“ gruppiert. Die Punktgröße stellt mittlere Unterschiede zwischen 30 und 4 °C-Bedingungen in jeder Region dar.

Mäuse wurden an einer Patchfaser (400 μm Kern, NA 0,5, RWD) befestigt, die mit 470- und 410-nm-Lichtquellen verbunden war. Die Faserphotometrie und der Aufnahmeaufbau wurden bereits beschrieben25. Das 470-nm-Anregungslicht wurde zur Messung des Ca2+-Signals und das 410-nm-Anregungslicht als Referenzsignal verwendet. Veränderungen im Ca2+-Fluoreszenzsignal (470 nm) wurden mit der Hintergrund-Ca2+-Fluoreszenz (410 nm) verglichen und stellten so eine interne Kontrolle für Bewegung und Signalbleiche bereit. Eine wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiterkamera (Hamamatsu, Orca Flash 4.0 v.2) wurde verwendet, um die Bilder der Patchkabel-Endflächen zu erfassen, und diese wurden mit einem zuvor beschriebenen MATLAB-Code25 verarbeitet. Zur Digitalisierung der Bilder mit 5 kHz wurde Datenerfassungshardware (National Instruments, NI PCIe-6343-X) verwendet. Die Signale wurden in dF/F ausgedrückt, wobei F die Grundlinienfluoreszenz darstellt. Die Videoaufzeichnung des Verhaltens wurde verwendet, um das Füttern und andere Verhaltensweisen manuell zu kommentieren und mit einem Zeitstempel zu versehen. AUC- und Spitzenwerte wurden für –20/–10 bis 10 s ab dem definierten Ereignis berechnet (für Fütterungs- bzw. HMM-Zustände).

Für Fasten-Nachfütterungs-Experimente ließ man die Mäuse 16 Stunden lang fasten. Die Mäuse wurden in eine hohe Kammer gesetzt und ihre Kanüle am Faserphotometrie-Aufbau befestigt. Den Mäusen wurde erlaubt, sich 30 Minuten lang daran zu gewöhnen, und ein Futtergerät (FED3) wurde an einer Ecke der Kammer platziert. FED3 wurde so programmiert, dass es 15 Minuten nach dem Einsetzen des Geräts in die Kammer mit der Verteilung der Pellets beginnt, um die Einführung von Lärm im Experiment zu vermeiden. Die Datenerfassung, -analyse und -verarbeitung erfolgte wie oben beschrieben.

Zwanzig Mäuse wurden in fünf Gruppen eingeteilt: 1 (2 Stunden, kalt), 2 (4 Stunden, kalt), 3 (2 Stunden, thermoneutral), 4 (4 Stunden, thermoneutral) und 5 (Heimkäfig, 0 Stunden). Die Quantifizierung der Blutplasmamessung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt: Maus-Leptin-ELISA-Kit (Crystal Chem, Nr. 90030), Kit zur Quantifizierung freier Fettsäuren (abcam, Nr. ab65341) und Assay-Kit für freies Glycerin (abcam, Nr. ab65337). ).

Wildtyp-C57BL/6-Mäuse wurden 4 Tage lang an den Aufbau gewöhnt (mit FED2), bevor ihr Verhalten bei 4 °C aufgezeichnet wurde. Für jede Maus wurden mit zwei separaten Logitech C270-Webkameras zwei Videos aufgenommen, eines von oben und eines von der Seite. Wir haben den Beginn und das Ende jedes Verhaltens manuell mit Anmerkungen versehen. Die Analysatoren waren für die Versuchsgruppen von Mäusen blind. Zu den Verhaltensweisen gehörten Sitzen, Zittern, Kopfpflege, Drehen, Pflege des Unterkörpers, Herausgehen, Essen, Zurückbewegen, Bettzeug schieben, Aufstehen, Bettzeug herausholen, Trinken, Graben, Schwanzpflege und Gehen. Das Verhalten wurde alle 1 Sekunde kommentiert. HMM erfordert eine Eingabesequenz, eine geschätzte Übergangsmatrix und eine geschätzte Emissionsmatrix. Die Eingabesequenz wurde mit Daten aus den zuvor manuell analysierten 180-minütigen Videos von Mäusen generiert, die 4–6 Stunden lang kalten Bedingungen ausgesetzt waren und freien Zugang zu Futter und Wasser hatten. Die Eingabesequenz jeder Maus wurde in einen Vektor eingefügt. Wir haben ein HMM mit drei Zuständen definiert: (1) energiesparender Zustand, (2) Erkundung mit Nahrungsaufnahme und (3) Erkundung ohne Nahrungsaufnahme. Wir haben die anfängliche Schätzung für die geschätzte Übergangsmatrix erstellt, indem wir für alle Übergänge gleiche Wahrscheinlichkeiten angenommen haben, da wir keine A-priori-Informationen hatten. Wir haben die erste Schätzung für die geschätzte Emissionsmatrix erstellt, indem wir die Verhaltenswahrscheinlichkeit in jedem Zustand vorhergesagt haben. Wir haben einen benutzerdefinierten MATLAB-Code unter Verwendung des Baum-Welch-Algorithmus verwendet, um Übergangs- und Emissionsmatrizen zu erfassen. Um den zugrunde liegenden Verhaltenszustand basierend auf einer Verhaltenssequenz zu berechnen, haben wir die in MATLAB integrierte Funktion hmmviterbi verwendet.

Für Basalplatzpräferenzmessungen aktivitätsabhängiger optogenetischer Mäuse wurden entweder ChR2-XiCIEC- oder RFP-XiCIEC-Mäuse in eine Zweikammer-Acrylbox (60 × 25 × 30 cm3) gegeben, wobei jede Seite der Kammer 30 × 25 misst cm2), bei Raumtemperatur (23 °C). Jede Kammer hatte unterschiedliche kontextbezogene Musterhinweise an der Wand: Eine Seite hatte ein schwarz-weiß gestreiftes Muster und die andere ein gepunktetes Muster. Die Mausbewegungen wurden während der gesamten 30-minütigen Sitzung mit einer Overhead-Webcam von Logitech mit Draufsicht aufgezeichnet. Mäuse wurden mehrere Stunden täglich mit einem Glasfaserkabel, das an ihren Kopfimplantaten befestigt war, eine Woche lang in einer hohen Kammer gewöhnt, bevor die Basalplatzpräferenz erfolgte. Die Videos wurden manuell anhand der in jeder Kammer verbrachten Zeit quantifiziert. Zur Messung des RTPP bei Raumtemperatur wurden Mäuse in die Mitte der Ortspräferenzkammer gestellt und der Laser eingeschaltet, wenn sich alle vier Pfoten der Maus in der Stimulationskammer befanden. Der Laser wurde manuell ein- (10 mW, 10 ms, 20 Hz) und ausgeschaltet, indem der Bediener im Nebenraum saß und dabei ein Live-Overhead-Video der Maus überwachte. Der Laser blieb eingeschaltet, während die Mäuse in der Stimulationskammer blieben, und schaltete sich aus, wenn sie die Kammer verließen. Um die Valenzänderung während der CIEC-Behandlung der Mäuse zu testen, wurden sie 5–6 Stunden lang bei 4 °C gehalten und hatten Zugang zu Nahrung und Wasser nach Belieben, bevor RTPP unter kalten Bedingungen durchgeführt wurde. Den Mäusen wurde eine einwöchige Pause zwischen RTPP bei 23 und 4 °C eingeräumt.

Um angstähnliches Verhalten in der Optogenetik-Kohorte zu messen, wurden Mäuse in die äußere Zone einer weißwandigen Acryl-Freifeldarena (60 × 60 cm2) gesetzt und die Bewegung wurde 20 Minuten lang mit einem Logitech-Web von oben aufgezeichnet Kamera. Der Laser wurde von einem im Nebenraum sitzenden Bediener intermittierend für einen Zeitraum von 3 Minuten ein- und ausgeschaltet, während er eine Live-Videoübertragung überwachte. Die Gesamtzeit und Distanz in den zentralen 40 % des Gebiets wurden mithilfe einer maßgeschneiderten automatisierten Tracking-Software analysiert. Der Freilandtest wurde für jede Maus nur einmal durchgeführt. Nach der Sitzung wurden die Mäuse in ihren Heimkäfig zurückgebracht.

Mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA wurde beurteilt, wie das Verhalten durch andere Faktoren beeinflusst wurde (z. B. RTPP, getestet durch optogenetische Manipulationen und Temperatur). Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein ungepaarter T-Test verwendet. Es wurden durchgehend zweiseitige Tests mit α = 0,05 verwendet. In jeder Abbildungslegende sind mehrere Vergleichsanpassungen, biologische Replikate und Signifikanzdefinitionen enthalten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle numerischen Daten sind in den Zusatzinformationen enthalten. Alle anderen Daten sind zu groß, um sie in einem öffentlichen Repository abzulegen, sind aber beim entsprechenden Autor erhältlich.

Auf den in dieser Studie verwendeten Code kann bei Zenodo zugegriffen werden, https://doi.org/10.5281/zenodo.7869467.

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Referenzen herunterladen

Wir danken J. Read, A. Brashears und A. Kanow für technische Unterstützung; H. Wang, H. Zhu und E. Zorrilla für die anfängliche Verhaltensaufstellung; Y. Wang für Illustrationen; Scripps Research Department of Animal Resources für Tierressourcen; und Mitglieder des Ye-Labors für Diskussionen. Wir danken L. Stowers, C. Kim, V. Augustine und W. Hong für ihr Feedback zum Manuskript. Wir danken AV Kravitz für FED3-Anträge und H. Bito für das ESARE-Plasmid. NKL wurde durch das AHA Postdoctoral Fellowship (20POST35200001), den Dorris Scholar Award und das Eric and Wendy Schmidt AI in Science Postdoctoral Fellowship unterstützt. PL wurde durch das Schmidt Science Fellowship und das Eric und Wendy Schmidt AI in Science Postdoctoral Fellowship unterstützt. TQ, ZP und DY wurden durch den Dorris Scholar Award unterstützt. LY wird vom National Institutes of Health Director's New Innovator Award (Nr. DP2DK128800), NIDDK (Nr. DK114165, DK134609 und DK124731), BRAIN Initiative/NIMH (Nr. MH132570), der Dana Foundation, der Whitehall Foundation und der Baxter Foundation unterstützt Foundation und der Abide-Vividion Endowment. ASB wird durch Auszeichnungen Nr. unterstützt. DK133948, DK107717 und OD028635.

Abteilung für Neurowissenschaften, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA

Neeraj K. Lal, Samarth Aggarwal, Alan Zhang, Kristina Wang, Tianbo Qi, Zhengyuan Pang, Dong Yang, Victoria Nudell und Li Ye

Abteilung für Zelluläre und Molekulare Medizin, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Phuong Le & Gene W. Yeo

Abteilung für Endokrinologie, Diabetes und Stoffwechsel, Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA, USA

Alexander S. Banks

Abteilung für Molekulare Medizin, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA

Li Ye

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Die Konzeptualisierung wurde von NKL und LY durchgeführt. Die Untersuchung und Analyse wurde von NKL, PL, SA, AZ, KW, TQ, ZP, DY, VN und ASB durchgeführt. Die indirekte Kalorimetrie wurde von ASB Modeling und die rechnerische Analyse von PL und GWY Funding durchgeführt Der Erwerb lag in der Verantwortung von LY. Die Projektverwaltung wurde von LY durchgeführt. Die Aufsicht wurde von LY, GWY und ASB übernommen. Das Schreiben des ursprünglichen Entwurfs lag bei NKL und LY. Alle Autoren trugen zum Schreiben, zur Überprüfung und Bearbeitung bei.

Korrespondenz mit Li Ye.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Qingchun Tong und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a–b, Balkendiagramme, die die durchschnittliche Nahrungsaufnahme (n = 24 Mäuse) (a) und den Energieverbrauch (n = 24 Mäuse) (b) für die in Abb. 1a–cc dargestellten Daten zeigen. Schematische Darstellung des Langzeit-Kälteexpositionsprotokolls. 5 Tage (115 h) nach Raumtemperatur (23 °C) wurde die Temperatur auf 4 °C umgestellt. weiß: helle Phase, grau: dunkle Phase. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001 unter Verwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests. d–e, Quantifizierung der Nahrungsaufnahme (n = 24 Mäuse) (d) und des Energieverbrauchs (n = 24 Mäuse) (e) während Hell- und Dunkelphasen vor und nach dem Temperaturwechsel. Zur Berechnung der durchschnittlichen Nahrungsaufnahme und des Energieverbrauchs wurden Werte von entweder 4 Tagen oder 4 Nächten sowohl für Raumtemperatur als auch für 4 °C (ohne den Tag der Temperaturumstellung) verwendet. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001 unter Verwendung eines zweiseitigen gepaarten t-Tests. f, Blutzuckerspiegel von WT-Mäusen 2 Stunden und 4 Stunden nach Kälteexposition (Zeitpunkte stammen von denselben Tieren) (n = 8 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. **P = 0,001 für den Vergleich zwischen 0 Stunden und 2 Stunden bei 4 °C, **P = 0,0028 für 0 Stunden gegenüber 4 Stunden bei 4 °C, unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett.

a: Unter Verwendung von 15 verschiedenen Bezeichnungen der von Mäusen im CIEC-Paradigma durchgeführten Aktionen schätzte ein HMM die Emissionsmatrix mit drei Zuständen (Energieeinsparung (Zustand 1), Erkundung mit Nahrungssuche und -konsum (Zustand 2) und Erkundung ohne Nahrung). suchen (Zustand 3)). (n = 3 Mäuse). b, Entsprechende Übergangsmatrixwahrscheinlichkeiten zwischen den einzelnen Zuständen. c, Übergangsmatrix verschiedener Aktionen, die die Maus während des CIEC-Zustands ausführt.

a–g: Gehirne wurden von Mäusen entnommen, die sich einer CIEC (6 Stunden bei kalten 4 °C) oder einer Nicht-CIEC (6 Stunden bei thermoneutralen 30 °C) unterzogen hatten. n = 4 Tiere pro Gruppe. Gesamthirnbildgebung und cFos-Kartierungsdaten für das gesamte Gehirn in a und einzelne Regionen der Großhirnrinde in b, Großhirnkerne c, Hypothalamus d, Mittelhirn e, Hinterhirn f und Kleinhirn g. Jeder Punkt repräsentiert eine kommentierte Gehirnregion basierend auf dem Allen Brain Atlas. Die Größe der Punkte stellt die mittleren Unterschiede zwischen warmen und kalten Bedingungen in den einzelnen Regionen dar. Siehe auch Ergänzungstabelle 1 für alle Regionen. Siehe auch Ergänzungstabelle 1.

a, CFOS-Quantifizierung der Re-Region aus Hauptabbildung 2b. (n = 4 Mäuse für jede Bedingung). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns, nicht signifikant unter Verwendung der gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnet. b, repräsentative Bilder von MnPO (bei Bregma 0,14) für dasselbe Experiment wie in der Hauptabbildung 2a – c gezeigt. c, Repräsentative Xi-Bilder von Mäusen nach 7 Tagen Kälteexposition (n = 4 für RT und Kälte). d: Repräsentative Xi c-Fos-Bilder von weiblichen Mäusen nach 5 Stunden Kälteexposition. (n = 2 für RT, n = 3 für kalt). Maßstabsbalken: 200 μm. e, Durchschnittliches Kalziumsignal von Xi-Neuronen, während die Umgebungstemperatur von 23 °C auf 4 °C sank. (gemittelt aus n = 3 Mäusen). f–g, Xi-Kalziumsignal für Mäuse, die sich im CIEC- oder CIEC+-Zustand befinden (4 °C ohne Nahrung für 3 Stunden, um eine verstärkte kälteinduzierte Energiekompensation zu erzeugen), die gepunktete rote Linie zeigt einen einzelnen Fütterungszyklus an. (n = 4 Mäuse). Die durchgezogene Linie ist der Durchschnitt und der schattierte Bereich ist das SEM. h, Quantifizierung von AUC Delta F/F und Peak Delta F/F. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001, **P = 0,01 unter Verwendung des zweiseitigen ungepaarten t-Tests. (n = 4 Mäuse) i, gemitteltes Calciumsignal von Xi-Neuronen von Mäusen, die CIEC unterzogen wurden, gemittelt aus 11 Ereignissen von 3 verschiedenen Mäusen. Die durchgezogene Linie ist der Durchschnitt und der schattierte Bereich ist das SEM. Die rot gepunktete Linie ist der mit HMM berechnete Zustandsübergangszeitpunkt. j–k, Faserphotometriesignal von AAV-GCaMP6m, das vMT/Xi-Neuronen exprimiert, nach Fasten über Nacht während der Nachfütterung bei Raumtemperatur (j) oder bei 30 °C (k), dargestellt als Durchschnitt von 35 Ereignissen von 5 verschiedenen Mäusen für (j). ) und 31 Ereignisse von 5 verschiedenen Mäusen für (k). Die durchgezogene Linie ist der Durchschnitt und der schattierte Bereich ist das SEM. l, Balkendiagramm, das die Fläche unter der Kurve (AUC) dF/F (−20 s bis 10 s) für j, k und Hauptabbildung 2f, g zeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001, ns = 0,8572 für den Vergleich zwischen 30 °C-Fütterung und Fasten-Wiederfütterung bei 30 °C, ns = 0,1678 für den Vergleich zwischen 30 °C-Fütterung und Fasten-Wiederfütterung bei 23 °C in einer Richtung ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest.

a–b, Quantifizierung der zirkulierenden Leptinspiegel bei Mäusen nach Aufenthalt in Kälte (a) oder bei 30 °C (thermoneutral) (b) für eine bestimmte Zeitspanne (n = 4 Mäuse). c–f, Quantifizierung von Plasmaglycerin (c und d) und freien Fettsäuren (e und f) für Mäuse in Kälte oder bei 30 °C (thermoneutral) (n = 4 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. *P = 0,0143 für FFA bei Kälte unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett.

a, Schematischer und repräsentativer Histologieabschnitt der vCAPTURE DREADD Gi-Maus. Maßstabsbalken: 500 μm. b, Nahrungsaufnahme für kalt-vCAPTURED Xi Gq, aktiviert bei 23 °C (n = 5 für RFP und Gq). c, Nahrungsaufnahmedaten für kalt-vCAPTURED Xi Gi bei 23 °C (n = 4 für RFP und n = 8 für Gi). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns > 0,99 für Gq, ns = 0,9163 für Gi-Nahrungsaufnahme bei 23 °C unter Verwendung eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests.

a, Schematischer und repräsentativer Histologieschnitt einer Maus, der am Xi konstitutiv (hSyn-ChR2) injiziert wurde. Maßstabsbalken: 500 μm. b, Experimentelles Design zum Testen der Wirkung der Massenaktivierung von Xi und umgebenden Neuronen auf die CIEC-assoziierte Fütterung. c–e, Nahrungsaufnahme vor und nach der Stimulation (n = 8 Mäuse, N = 16 Mal) (c) und d–e körperliche Aktivität (gemessen als zurückgelegte Gesamtstrecke) vor und nach der Stimulation (d) (n = 8 Mäuse) und individuelle Bewegungsspuren eines einzelnen Tieres (e). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001 und *P = 0,0184 unter Verwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests. f, Nahrungsaufnahme und körperliche Aktivität von Tieren, die konstitutives ChR2 im Xi bei RT exprimieren (n = 8 Tiere). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ****P < 0,0001, **P = 0,0096 unter Verwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests.

a, Schema des Freilandtests. b–d, Quantifizierung der draußen verbrachten Zeit (b) oder der drinnen verbrachten Zeit (c) (oder des Verhältnisses davon (d) nach Aktivierung von vCAPTUREd XiCIEC-Neuronen in ChR2- oder RFP-Kontrollmäusen (n = 11 für ChR2 und n = 6 für RFP). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns = 0,6087 für (b) und (c), ns = 0,5380 für (d) unter Verwendung eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests. e–f, Balkendiagramm, das den Unterschied in der Nahrungsaufnahme bei Thermoneutralität zeigt Temperatur vor und nach der Laserstimulation für ChR2-Mäuse in e (n = 11) und RFP-Mäuse in f (n = 11). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns = 0,1501 für e und ns = 0,4650 für f unter Verwendung zweischwänziger Paare t-Test. g–h, Nahrungsaufnahme (g) und körperliche Aktivität (h) für vCAPTURED XiCIEC-Mäuse, stimuliert bei Raumtemperatur (n = 11 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ns = 0,1530 für g und ns = 0,7614 für h unter Verwendung eines zweischwänzigen gepaarten t-Tests. i, Wahrscheinlichkeit eines kontinuierlichen Zustands berechnet für ChR2-Mäuse, vor der Stimulation (weißer Hintergrund) oder nach der Stimulation (blauer Hintergrund) während einer CIEC (n = 7 Mäuse).

a, Schematische und repräsentative Histologie, die die Injektion eines viralen AAV-DIO-ChR2 und ein optogenetisches Implantat am Xi (durchgezogene weiße Linie zeigt die Faserspur an) bei vGLUT2-Tieren zeigt. Maßstabsbalken: 500 μm. b–c, Nahrungsaufnahme bei Kälte vor und nach der Stimulation für vGLUT2-ChR2-Mäuse (b) (n = 8 Mäuse) und für vGLUT2-RFP-Kontrollmäuse (c) (n = 8 Mäuse). de, Nahrungsaufnahme für vGLUT2-ChR2-Mäuse (d) und vGLUT2-RFP-Mäuse (e) vor und nach der Stimulation unter thermoneutralen Bedingungen. f, Schema und Histologie von vGAT2-Tieren. Maßstabsbalken: 500 μm. g–j, Nahrungsaufnahme bei Kälte vor und nach der Stimulation (g–h) und unter thermoneutralen Bedingungen (ij). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für bj. ***P = 0,009 für b, ns = 0,7849 für c, ns = 0,4869 für d, ns = 0,8018 für e, ns = 0,6682 für g, ns = 0,8383 für h, ns = 0,5490 für i, ns = 0,47 für j durch zweischwänzigen gepaarten t-Test. k, Schematische Darstellung des Faserphotometrie-Aufbaus für die Aufzeichnung von vGLUT2-Xi, injiziert mit Dio-GCam6m am Xi bei vGLUT2-Tieren. l, Faserphotometriesignal von AAV-Dio-GCaMP6m, das in vGLUT2-Xi-Neuronen in der Kälte exprimiert, dargestellt als Durchschnitt von 15 Ereignissen von 4 verschiedenen Mäusen. Die durchgezogene Linie ist der Durchschnitt und der schattierte Bereich ist das SEM.

a, Schematische Darstellung der viralen AAV-ChR2-Injektion am Xi und des optogenetischen Implantats oberhalb der BLA bei WT-Tieren. b, Nahrungsaufnahme und körperliche Aktivität bei Kälte vor und nach der Laserstimulation für Xi-BLA-Mäuse (n = 8 Mäuse). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, ns = nicht signifikant unter Verwendung des zweiseitigen gepaarten t-Tests. c, Schematische Darstellung der AAV-ChR2-Injektion am Xi und des optogenetischen Implantats oberhalb von BLA und NAc im selben Tier. d–e, Zeitleiste (d) und Nahrungsaufnahmedaten (e) für das Experiment, bei dem zuerst die BLA und dann die NAc stimuliert wurden. Die Nahrungsaufnahme wird für die Vorstimulation, für die BLA nach der Stimulation und für die NAc nach der Stimulation aufgezeichnet. f–g, Zeitleiste (f) und Nahrungsaufnahmedaten (g) für Experimente, bei denen NAc vor BLA stimuliert wurde. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. **P = 0,0063, ns = 0,8083 für e, **P = 0,0028, ns = 0,7924 für g unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett.

Gesamthirn-c-Fos-Quantifizierung von kalten im Vergleich zu thermoneutralen Bedingungen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lal, NK, Le, P., Aggarwal, S. et al. Der Xiphoidkern des Mittellinien-Thalamus steuert die durch Kälte verursachte Nahrungssuche. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06430-9

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Eingegangen: 11. August 2022

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06430-9

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